引言：
腎臟類器官的培養(yǎng)首先用高濃度的CHIR99021刺激HIPSC進(jìn)行2Ｄ培養(yǎng)，促進(jìn)其向原條中胚層分化，隨后加入CHIR99021、FGF-9因子誘導(dǎo)其向間介中胚層分化；最后將細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)入Transwell小室內(nèi)進(jìn)行為期12天的3D立體誘導(dǎo)，最終獲得腎臟類器官。
一、實(shí)驗(yàn)材料
1. Matrigel人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)用基質(zhì)膠(Corning, Cat#354277)，于冰上分裝后保存于-80℃；
2. APEL 干細(xì)胞分化培養(yǎng)基（Stemcell，Cat#05271）；
3. Knock Out Serum Replacement(Thermo, Cat#A3181502), 分裝后保存于-20℃；
4. mTeSR?1 (Stemcell Technologies, Cat#85850)；
5. FGF-9(PeproTech, Cat#100-23)配制為200μg/ml, 保存于-80℃，使用終濃度為200ng/ml；
6. Y-27632 (BioGems, Cat# 1293823)配制為10mM, 保存于-80℃，使用終濃度為10μM；
7. CHIR99021 (BioGems, Cat# 2520691)配制為8mM, 保存于-80℃，使用終濃度為8μM；
8. Accutase消化液(Thermo, Cat#A1110501)。
二、 ESCs/iPSC培養(yǎng)傳代步驟
1. hESCs的復(fù)蘇：預(yù)先將Matrigel（Cat#354277）從-80℃取出，置于冰上融化，隨后用預(yù)冷的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋100倍，取1ml加入六孔板一個(gè)孔，晃勻至鋪滿孔板底部。六孔板置于37℃培養(yǎng)箱中至少30min，備用。mTesR1人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基提前從4℃冰箱取出，室溫放置約10min。從液氮凍存盒中取出H9細(xì)胞(hESC細(xì)胞系)，快速移入37℃水浴鍋中融化，輕柔晃動至凍存管還剩小塊冰即取出，小心將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15ml離心管，加入５ml mTesR1培養(yǎng)基輕輕混勻細(xì)胞，1000rmp/5min離心，小心棄去上清，加入含10μM的Y-27632的mTesR1培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞接種于基質(zhì)膠包被的培養(yǎng)板，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日加入DMEM/F12培養(yǎng)基輕柔洗一次，更換新鮮不含Y-27632的mTesR1培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
2. hESCs的培養(yǎng)：每天更換新鮮mTesR1培養(yǎng)基前應(yīng)觀察細(xì)胞狀態(tài)，若發(fā)現(xiàn)大量死細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)基（剛復(fù)蘇的細(xì)胞狀態(tài)較差），則棄去培養(yǎng)基，加入預(yù)熱的DMEM/F12培養(yǎng)基輕柔洗細(xì)胞一次，棄去DMEM/F12培養(yǎng)基，加入新鮮mTesR1培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
3. hESCs的傳代：細(xì)胞約3~5天生長至80%匯合度，狀態(tài)良好的hESCs克隆明顯，邊緣光滑。細(xì)胞傳代時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要提前用Matrigel包被培養(yǎng)板，傳代比例為1：5~1：10，細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基洗2次，在六孔板每孔中加入1ml Accutase消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化3~5min。每隔2min在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，待克隆邊緣發(fā)亮即小心棄去消化液，加入2ml含含10μM的Y-27632的mTesR1培養(yǎng)基輕柔吹打細(xì)胞數(shù)次，收集細(xì)胞于15ml離心管，1000rmp/5min離心，小心棄去上清，加入含10uM的Y-27632的mTesR1培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入基質(zhì)膠包被的培養(yǎng)板，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。過夜后更換新鮮的不含Y-27632的mTesR1培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液。
4. hESCs的凍存：凍存液為含5~10％二甲基亞砜（DMSO）的血清替代品(KOSR)，置于４°Ｃ備用。按照前述細(xì)胞傳代的方法收集細(xì)胞，用細(xì)胞凍存液輕柔重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入凍存管，做好標(biāo)記，置于凍存盒，-80℃過夜后轉(zhuǎn)入液氮中長期保存。
三、 腎臟類器官誘導(dǎo)方案的選擇
1. 原條中胚層(PS)階段的誘導(dǎo)（Day0-Day3）：待H9細(xì)胞在孔內(nèi)融合度達(dá)到60-80%左右，細(xì)胞可進(jìn)行誘導(dǎo)。按上述hESCs的傳代步驟操作，用Accutase消化液把細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，按2×104/cm2 密度進(jìn)行接種，加入含8μM CHIR99021的APEL細(xì)胞分化培養(yǎng)基，吹打混勻，以此濃度維持培養(yǎng)３天，在第1.5天時(shí)進(jìn)行一次換液。
2. 間介中胚層（IM）階段的誘導(dǎo)（Day3-Day6）：PS階段形成后，更換為含200ng/ml FGF-9和1μg/ml heparin的APEL細(xì)胞分化培養(yǎng)基,，吹打混勻，培養(yǎng)３-5天，隔天換液一次。
3. IM細(xì)胞轉(zhuǎn)入３Ｄ培養(yǎng)（Day6）：進(jìn)將Day7獲得的細(xì)胞用0.05%胰酶消化３分鐘，用DMEM培養(yǎng)基中和消化后，對獲得的細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。按照大約每個(gè)類器官0.5X106個(gè)細(xì)胞的量，將含有該數(shù)目細(xì)胞的懸液分裝到各個(gè)15ml離心管中，配平后進(jìn)行離心，400g離心2min。離心結(jié)束后用細(xì)胞鏟刮取滴管底部的細(xì)胞團(tuán)。注意，細(xì)胞團(tuán)的完整性對于后續(xù)誘導(dǎo)能否成功具有至關(guān)重要的影響作用，因此此步驟一旦發(fā)生細(xì)胞團(tuán)部分松散，則必須以同樣離心速度再次離心后再嘗試刮取。若再次失敗，建議進(jìn)行第三次嘗試或放棄該細(xì)胞。將細(xì)胞團(tuán)從離心管底部刮下后，將其吸入滴管內(nèi)，轉(zhuǎn)移到Transwell小室中4μm的膜上。
4. IM細(xì)胞向成熟的UB或ＭＭ細(xì)胞方向過渡（Day6-Day13）：再上述Transwell小室底部加入含5μM CHIR99021APEL培養(yǎng)基（大約1.3ml）刺激1h，使培養(yǎng)基液面剛好浸沒Transwell膜的底部,刺激后再培養(yǎng)基內(nèi)添和200ng/ml FGF-9和1μg/ml heparin。在剩余的一周內(nèi)，僅用同濃度的FGF9和heparin進(jìn)行培養(yǎng)。每天上下午兩次搖動六孔板，使培養(yǎng)基獲得一定的流動性，防止局部代謝廢物堆積；每２天換液一次，防止液體蒸發(fā)導(dǎo)致的類器官干涸。
5. 腎臟細(xì)胞進(jìn)一步成熟（Day13-Day18）：在后續(xù)的誘導(dǎo)過程中，換用不含任何誘導(dǎo)因子的APEL培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6天。注意事項(xiàng)同上步。
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