小腸、胃類器官的免疫熒光染色方法
1、吸去培養(yǎng)板孔內(nèi)的培養(yǎng)液，用 PBS 清洗三次，棄去 PBS；
2、往基質(zhì)膠孔內(nèi)加入 4%多聚甲醛固定 15 min；
3、用 PBS 清洗三次，用亞甲基藍(lán)將基質(zhì)膠染色以便于辨認(rèn)；
4、再用 PBS 清洗二次，將類器官從 24 孔培養(yǎng)板內(nèi)輕輕刮下來，保持基質(zhì)膠的完整性；
5、將基質(zhì)膠與包埋劑混合裝入自制小龕（錫箔紙制作）中，-80℃凍存；
6、進(jìn)行冰凍切片，厚度為 6 μm/ 張；
7、冰凍切片 55℃烤箱放置 2 h 后，將類器官所在位置周邊畫一蠟圈標(biāo)記，用 PBS 清洗三次，每次 5 min；
8、封 閉 30 min，封 閉 液 為 含 10% 羊 血 清、0.3%TritonX-100 的 PBS 溶液；
9、孵育一抗（根據(jù)說明書上的稀釋比例進(jìn)行稀釋），放于 4℃冰箱，孵育過夜；
10、第二天，將玻片拿出，用 PBS 清洗，每次 5min，共 3 次；
11、根據(jù)一抗的種屬情況，選擇不同的熒光二抗進(jìn)行避光孵育，熒光二抗稀釋比例為 1：200，孵育時間為 1h；
12、用 PBS 清洗，每次 5 min，共三次；
13、避光孵育核染料 Hoechst 染細(xì)胞核（稀釋比例為 1:1000），時間為 15 min。注意避光操作；
14、用 PBS 清洗，每次 5 min，共三次；
15、用 50% 甘油封片，熒光顯微鏡觀察熒光染色情況，進(jìn)行拍照。
流式染色樣本處理方法
1、將培養(yǎng)培養(yǎng)板孔內(nèi)培養(yǎng)液吸盡；
2、取 Cell Recovery Solution 溶液按 0.5 ml/ 孔（24 孔板）加入孔板內(nèi)，用槍尖刮下基質(zhì)膠，吹打數(shù)下，轉(zhuǎn)入 15 ml 離心管內(nèi)，冰上靜置 20min后，置 入 4℃離 心 機(jī) 離 心 5 min，轉(zhuǎn) 速 為 1000rpm，吸掉上層 Cell Recovery Solution 溶液；
3、加入胰酶消化類器官，37℃孵育 10 min，間斷用槍頭輕柔吹打為單細(xì)胞懸液（可將類器官放回培養(yǎng)板孔內(nèi)進(jìn)行消化，期間有利于觀察消化情況）；
4、用 10%FBS 終止消化，用 40 μm 濾網(wǎng)過濾掉碎片或細(xì)胞團(tuán)塊。 300g/ 5min 離心，再用 PBS 洗滌一次，再以 300g /5 min 離心；
5、離心完后棄去上清液，PBS 重懸細(xì)胞計數(shù)，取 1*106 細(xì)胞進(jìn)行流式染色。
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