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引言
2009年，Hans Clevers和其實(shí)驗(yàn)室的博士后Toshiro Sato用來(lái)源于小鼠腸道的成體干細(xì)胞培育出首個(gè)微型腸道類器官，掀起了類器官研究的熱潮。2011年，Sato等運(yùn)用類器官技術(shù)率先建立了腫瘤類器官，他們是在小鼠結(jié)腸隱窩的培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)人小腸和結(jié)腸的類器官，再通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化調(diào)整，從結(jié)腸腺瘤和腺癌及Barrett食管中建立腫瘤類器官模型。。癌癥患者來(lái)源腫瘤類器官模型的建立，被認(rèn)為是類器官培養(yǎng)技術(shù)的又一重大突破，腫瘤類器官是源自腫瘤組織中腫瘤特異性干細(xì)胞通過(guò)三維組織培養(yǎng)形成的細(xì)胞簇，它可模擬體內(nèi)腫瘤特征及腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性，該技術(shù)的建立未為癌癥研究和治療提供了可靠的模型，特別是為個(gè)性化癌癥治療開辟了新的視野。目前，科研人員通過(guò)優(yōu)化各種培養(yǎng)條件成功產(chǎn)生了許多腫瘤類器官，包括結(jié)腸癌、前列腺癌、胃癌、 乳腺癌和胰腺癌、宮內(nèi)膜/卵巢癌、子宮癌肉瘤、尿路上皮癌和腎癌等。與傳統(tǒng)腫瘤研究模型相比，腫瘤類器官可以最大程度地模擬腫瘤在體內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能，既能直觀展現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)的過(guò)程，又能反映患者個(gè)體差異，是一種直觀、可靠、高效和避免倫理爭(zhēng)議的器官水平研究體系，更加適合于體外的腫瘤生物學(xué)和治療相關(guān)的研究。
表一：腫瘤類器官發(fā)展歷程表
一、腫瘤類器官的培養(yǎng)與鑒定
腫瘤類器官將患者腫瘤組織分離獲得的腫瘤細(xì)胞（含有腫瘤干細(xì)胞）在加入一定的細(xì)胞因子和小分子建立類似體內(nèi)的微環(huán)境中進(jìn)行3D培養(yǎng)，形成微型腫瘤模型，其具有與來(lái)源腫瘤組織相似的結(jié)構(gòu)特征和功能特性, 而且能夠在體外3D培養(yǎng)體系中穩(wěn)定擴(kuò)增。腫瘤類器官的涉及到三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，第一是取材，第二是培養(yǎng)方案，第三鑒定方案。
1.腫瘤類器官的取材
腫瘤類器官取材的樣本絕大部分都是選擇腫瘤組織或者腫瘤細(xì)胞，也有少部分是選擇用ips細(xì)胞誘導(dǎo)。對(duì)于取材樣本的要求，腫瘤組織的取樣方式包括手術(shù)，活檢，無(wú)論什么方式，我們一般要求至少采集三個(gè)不同部位，每個(gè)部位大概黃豆大小，要避免取到壞死組織，壞死組織顏色上呈現(xiàn)黃色，腫瘤組織樣本在取材以及運(yùn)輸過(guò)程中可能會(huì)引起污染，這就要求我們?cè)谌〔脑搭^上就要注意可能帶來(lái)的污染，同時(shí)樣本應(yīng)當(dāng)放在含有雙抗(青霉素-鏈霉素)的組織運(yùn)送液中，在微生物陽(yáng)性區(qū)域采集的樣本除了要加入雙抗外，還需要額外添加其他抗生素，例如Primocin（原代細(xì)胞抗生素）、vancomycin（萬(wàn)古霉素）、gentamicin（慶大霉素）等。腫瘤組織取到后需要盡快進(jìn)行處理，將樣本剪成乳糜狀，加入消化酶進(jìn)行消化，這個(gè)消化方案一般是參考正常組織的消化方法，包括膠原酶，DNA酶，透明質(zhì)酸等；如果是選用循環(huán)腫瘤細(xì)胞需要通過(guò)對(duì)應(yīng)標(biāo)記的maker進(jìn)行分選；如果是腹水里面提取腫瘤細(xì)胞需要去除一些雜質(zhì)細(xì)胞，建議收集300-500ml腹水，離心去除雜質(zhì)，可鏡下觀察是否有腫瘤細(xì)胞。一般穿刺和內(nèi)鏡活檢組織培養(yǎng)的成功率較低，因?yàn)椴豢杀苊鈺?huì)有正常細(xì)胞的污染，而在腫瘤類器官培養(yǎng)體系中正常細(xì)胞的增值速度是大于腫瘤干細(xì)胞。
2.誘導(dǎo)方案的確定
腫瘤類器官誘導(dǎo)培養(yǎng)基的調(diào)試是腫瘤類器官培養(yǎng)最關(guān)鍵的部分，腫瘤類器官不同于正常類器官的培養(yǎng)，他的誘導(dǎo)因子不是固定的，因?yàn)槟[瘤患者本身具有個(gè)體化差異，這也導(dǎo)致了商品化的腫瘤類器官培養(yǎng)基開發(fā)極其困難。當(dāng)然這個(gè)里面有些成分是固定的，誘導(dǎo)細(xì)胞因子也主要是以Noggin, R-Spondin, EGF為主，誘導(dǎo)小分子以Y-27632, N-acetyl-L-Cysteine為主，其他細(xì)胞因子和小分子根據(jù)對(duì)應(yīng)的正常類器官培養(yǎng)方案進(jìn)行組合添加篩選。
表二：細(xì)胞因子和小分子在這個(gè)過(guò)程中起的作用包括以下這些：
Wnt-R-Spondin-1信號(hào)通路激活圖（左圖單獨(dú)Wnt，無(wú)法激活，右圖Wnt+R-Spondin-1可持續(xù)激活）
3.腫瘤類器官的鑒定
腫瘤類器官的鑒定，從組織病理學(xué)進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察（細(xì)胞水平），腫瘤標(biāo)志物的染色鑒定（蛋白水平），基因表達(dá)變化及基因突變分析（基因水平），藥敏活性測(cè)試（功能應(yīng)用）這四個(gè)方面與來(lái)源腫瘤組織進(jìn)行比較。培養(yǎng)后的腫瘤類器官需要與來(lái)源腫瘤組織保存高度一致。以下表格列出常見種類類器官的培養(yǎng)方案和鑒定標(biāo)準(zhǔn)。
二、腫瘤類器官的優(yōu)勢(shì)
腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤異質(zhì)性的重要原因之一，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中一類具有自我更新、增殖及分化潛能的細(xì)胞群，與腫瘤形成、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，腫瘤干細(xì)胞可分化形成與原發(fā)腫瘤中類似的異種細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了體外模型保留腫瘤異質(zhì)性的目的。因此腫瘤類器官的應(yīng)用主要集中在以下四個(gè)方面，抗腫瘤藥物篩選，藥物毒性測(cè)定，腫瘤類器官建庫(kù)，研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制，我們都知道在腫瘤類器官之前，腫瘤新藥的篩選主要依靠體外腫瘤細(xì)胞直接培養(yǎng)或者PDX模型，這兩種方法缺陷比較明顯，首先是2D培養(yǎng)很難模擬體內(nèi)真實(shí)的情況，因此得到的數(shù)據(jù)參考價(jià)值不高，PDX模型雖然可以部分模擬體內(nèi)的情況，但是其構(gòu)建成本高，周期長(zhǎng)，很多時(shí)候腫瘤患者等不急出結(jié)果。因此腫瘤類器官模型是目前最優(yōu)選的腫瘤篩選工具。來(lái)自英國(guó)倫敦癌癥研究所的Nicola Valeri博士就在Science上發(fā)表了最新研究通過(guò)對(duì)71名已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移并且經(jīng)歷了多種治療方案的晚期結(jié)腸癌和胃食道癌患者進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)類器官在預(yù)測(cè)抗癌藥物的有效性上，具有100%敏感性、93%特異性、88%陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、100%陰性預(yù)測(cè)值。腫瘤類器官還可以在抗腫瘤藥物篩選中輔助進(jìn)行藥物毒性測(cè)定，篩選出最優(yōu)的抗腫瘤藥物。
三、腫瘤類器官未來(lái)挑戰(zhàn)
但腫瘤類器官還具有一定的局限性，其中之一就是該模型中神經(jīng)、血管及免疫細(xì)胞所形成的腫瘤微環(huán)境的缺乏，這就使其不能完全表現(xiàn)出腫瘤在體內(nèi)的發(fā)生發(fā)展的全部特征，導(dǎo)致細(xì)胞或組織失去體內(nèi)真實(shí)的腫瘤形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能，并喪失異質(zhì)性。異質(zhì)性是腫瘤的重要生物學(xué)特征之一，與耐藥和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是腫瘤治療失敗的主要原因，也是腫瘤生物學(xué)體外研究結(jié)果在臨床試驗(yàn)中重復(fù)率不高的主要原因之一。未來(lái)聚焦到主要可以集中在以下幾個(gè)方面：
1）提高生成效率，縮短類器官模型的培養(yǎng)周期，降低培養(yǎng)成本；
2）目前的類器官主要來(lái)源于上皮細(xì)胞，需要進(jìn)一步研究非上皮類器官的培養(yǎng)方式；
3）目前暫無(wú)一個(gè)具有類器官的最優(yōu)培養(yǎng)條件的標(biāo)準(zhǔn)化方案；
4）病理、基因組學(xué)、藥物敏感度等方面對(duì)類器官和腫瘤的一致性進(jìn)行驗(yàn)證。
類器官作為有著廣闊應(yīng)用前景的技術(shù)，有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，我們有理由投入更多的時(shí)間和精力來(lái)發(fā)揚(yáng)它的優(yōu)勢(shì)、完善不足、探索新的應(yīng)用領(lǐng)域，相信會(huì)對(duì)未來(lái)的基礎(chǔ)研究和臨床診療產(chǎn)生積極的影響。
四、腫瘤類器官培養(yǎng)相關(guān)小分子和細(xì)胞因子
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