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引言
作為實驗室經(jīng)典技術(shù)之一 ，免疫組織化學(xué)法（Immunohistochemistry，IHC）在惡性腫瘤的診斷研究腫瘤細胞類型的鑒定，
預(yù)后，感染的診斷，腎臟病理，淋巴病理，預(yù)測靶向治療的使用等方向具有廣泛應(yīng)用，同時也可作為其他實驗技術(shù)中的輔助研究手段。接下來，
小編便給大家分享本實驗技術(shù)的詳細操作步驟并對實驗結(jié)果中的常見問題提供可能的解決思路，歡迎大家評論區(qū)進行交流，分享經(jīng)驗，共同進步。
01
概念介紹
應(yīng)用免疫學(xué)及組織化學(xué)的原理，即通過抗原和抗體之間的結(jié)合及呈色反應(yīng)，對組織切片或細胞標(biāo)本中的某些成分進行原位的定性、定位或定量的研究。
02
實驗步驟
組織標(biāo)本的制備（以冰凍組織切片為例）
將錫箔紙折為高度約為 1.5 cm 的小籃，作為包埋模具。加入冷凍包埋劑，將取出的新鮮組織完全浸入冷凍包埋劑中；將包埋模具放入盛有少量（僅沒過容器底即可）2-甲基丁烷的容器中(作為過渡，可有效防止冰晶的形成)，迅速轉(zhuǎn)移容器至液氮，快凍 1-2 min，隨后轉(zhuǎn)移組織，保存于-80℃。冰凍切片機切片，機內(nèi)溫度設(shè)置為-22℃，厚度為5-10μm(實驗允許范圍內(nèi)盡可能薄，可有效降低組織染色過程的邊緣效應(yīng)或脫片情況)。新鮮切制的切片烘片機70℃烤片2-3h，若是于-80℃冰箱取出的切片則需要放置于通風(fēng)櫥室溫晾置1.5-2h，烤片或晾片結(jié)束后用雙蒸水潤洗切片以去除包埋劑，隨后使用免疫熒光固定液固定切片10-15min。
抗原修復(fù)
切片完全置于抗原修復(fù)液，微波爐高火5min加熱至沸騰，以暴露抗原位點，隨后取出自然冷卻至室溫，若時間緊張可置于自來水中加速冷卻，重復(fù)此步驟一次。
注:因加熱時會存在蒸發(fā)問題，固需隨時觀察切片情況并對抗原修復(fù)液進行及時更換或補充，確保切片完全浸入于修復(fù)液中。
阻斷
切片放入氧化阻斷液(可使用甲醇+3%過氧化氫，以去除內(nèi)源性過氧化氫酶)中避光阻斷30min(至少30min，可根據(jù)實際情況適當(dāng)延長至45min，減少非特異性結(jié)合)，結(jié)束后使用免疫組化筆圈出組織。
封閉
使用正常動物血清或免疫染色封閉液封閉1-2h，可適當(dāng)延長時間以減少非特異性結(jié)合。
孵育一抗
一抗使用免疫熒光染色一抗稀釋液稀釋，稀釋比例具體可查看一抗說明書，需在合適范圍內(nèi)摸索合適比例(若實驗材料珍貴可進行預(yù)實驗摸索合適濃度，避免浪費)，4℃孵育過夜。
注:抗體滴加前需保證切片已干燥無水分殘留，避免因水分殘留而導(dǎo)致組織抗體孵育不均勻,最終致使染色不均。
孵育二抗
滴加酶標(biāo)記二抗(一般無需稀釋直接使用,注意使用時核對種屬是否正確)，室溫孵育45min。
顯色
按照說明書推薦的比例配置DAB工作液，吹打混勻后滴加于組織切片進行顯色，需注意DAB顯色液需現(xiàn)用現(xiàn)配，建議可將玻片放置于白紙上再進行滴加DAB工作液，以便于及時觀察組織顏色變化，出現(xiàn)棕黃色反應(yīng)時及時將玻片放入單蒸水中潤洗，隨后晾干中性樹膠封片，正置顯微鏡觀察并拍照。
03
實驗結(jié)果常見問題及解決方案
問題可分為三類：陰性結(jié)果（即無陽性信號）,非特異性染色（有陽性信號）和著色不均
陰性結(jié)果
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可能原因 解決方案 |
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抗體質(zhì)量存在問題 |
更換高質(zhì)量、品質(zhì)有保障的抗體 |
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抗體濃度 |
進行預(yù)實驗摸索抗體使用濃度 |
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抗原修復(fù)不全 |
更換合適的抗原修復(fù)方式及修復(fù)時間 |
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封閉時間過長 |
減少封閉時間 |
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DAB孵育時間短 |
鏡下控制顯色時間 |
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細胞通透不充分，抗體未能進入 |
選擇合適的通透劑及其反應(yīng)時間 |
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抗原豐度 |
正常陰性 |
非特異性染色
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可能原因 解決方案 |
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抗體質(zhì)量存在問題 |
更換高質(zhì)量、品質(zhì)有保障的抗體，盡量使用單克隆 抗體 |
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抗體抗體濃度過高或孵育時間過長 |
降低抗體濃度和孵育時間 |
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切片在緩沖液中浸泡過久 |
抗原修復(fù)之后及時封閉不可浸泡過夜 |
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存在內(nèi)源性過氧化物酶及生物素 |
延長滅活時間 |
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封閉時間不足 |
延長封閉時間 |
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DAB孵育時間過久或濃度過高 |
按說明書配置，并及時于鏡下觀察控制反應(yīng)時間 |
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抗體孵育后洗滌不充分 |
每次孵育之后洗3*5次 |
著色不均
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可能原因 解決方案 |
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組織切片厚度不均勻 |
切片時更換刀片并重新調(diào)整切片機參數(shù) |
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試劑配制時未混勻，濃度不均一 |
試劑充分混勻后進行滴加 |
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試劑未完全覆蓋組織 |
滴加試劑時保證試劑可完全覆蓋組織 |
04
高質(zhì)量抗體品牌推薦
正能生物
成都正能生物（ZEN-BIOSCIENCE）成立于2007年，致力于為全球生命科學(xué)研究機構(gòu)及生物技術(shù)企業(yè)研制高品質(zhì)的抗體產(chǎn)品，從而促進生命科學(xué)和人類健康事業(yè)的發(fā)展！
公司科研團隊由來自哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院及中國科學(xué)院等著名科研院所的科學(xué)家領(lǐng)軍，在科學(xué)研究及抗體應(yīng)用領(lǐng)域具有豐富的經(jīng)驗。正能先后與中國科學(xué)院、清華大學(xué)、上海交通大學(xué)和四川大學(xué)等單位建立了深度合作關(guān)系，共同發(fā)掘了諸多前沿領(lǐng)域的相關(guān)靶點及檢測標(biāo)志物產(chǎn)品，服務(wù)國內(nèi)外上千家科研單位。
公司研發(fā)生產(chǎn)的蛋白和抗體產(chǎn)品覆蓋了現(xiàn)代生命科學(xué)研究的各大前沿領(lǐng)域，包括癌癥、免疫學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、心血管疾病、腫瘤干細胞、表觀遺傳學(xué)和內(nèi)分泌與代謝等?，F(xiàn)有目錄產(chǎn)品20000余種，其中多種產(chǎn)品為全球獨家所有。正能生物秉持認(rèn)真、細致的產(chǎn)品觀念，嚴(yán)格控制產(chǎn)品品質(zhì)?！疤峁﹥?yōu)質(zhì)的抗體產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)，成為科學(xué)界和產(chǎn)業(yè)界值得信賴的合作伙伴”是正能不懈的追求！
博士德生物工程有限公司
(Boster Biological Technology co.ltd)于1993年成立，總部位于武漢光谷，美國公司Bosterbio于2011年在加州成立，是一家以研發(fā)、生產(chǎn)、銷售為一體的生物公司。公司成立之初，就樹立了“技術(shù)創(chuàng)新”的科研理念，在不斷創(chuàng)造業(yè)界奇跡的同時，也吸引了眾多國內(nèi)外生物學(xué)領(lǐng)域有著深厚造詣和豐富經(jīng)驗的科研人才加盟，配備了全套高新技術(shù)實驗設(shè)備，全程自主研發(fā)，迄今為止抗體已經(jīng)達到20000多種，ELISA試劑盒達到1700多種，產(chǎn)品在全球科研工作者使用并發(fā)表文獻多達50000多次，廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外1000多家科研單位、院校、醫(yī)院、工業(yè)藥企。
參考文獻
[1].Jensen, Ellen C . Quantitative Analysis of Histological Staining and Fluorescence Using ImageJ[J].
The Anatomical Record, 2013, 296(3):378-381.
[2].Varghese F, Bukhari A B, Malhotra R, et al. IHC Profiler: An Open Source Plugin for the Quantitative Evaluation
and Automated Scoring of Immunohistochemistry Images of Human Tissue Samples[J]. Plos One, 2014, 9(5):e96801.
