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流式細(xì)胞儀是免疫學(xué)研究的重要檢測儀器，儀器價值高，檢測參數(shù)多，初學(xué)者不易掌握。本文主要探討流式檢測中經(jīng)常忽視并且容易混淆的流式參數(shù)A, H, W。流式細(xì)胞儀檢測信號時，每一個細(xì)胞通過激光，儀器都會檢測到一個光信號，由PMT（光電倍增管）放大將光信號轉(zhuǎn)換成電脈沖信號，從細(xì)胞進(jìn)入檢測點，到細(xì)胞離開檢測點，電脈沖信號由0到達(dá)峰值，再降為0，被記錄成一個峰值， H是電脈沖信號的高度（H, height），代表脈沖信號的峰值，W是脈沖信號的寬度（W, width），指細(xì)胞通過激光檢測區(qū)域的時間，H和W是直接檢測出來的，A指的電脈沖信號的面積（A, area），是經(jīng)過儀器設(shè)置計算處理的。由于A是通過W和H的數(shù)值計算出來的，在儀器上分辨率會更高。
圖1：流式參數(shù)A, H, W產(chǎn)生過程
通常我們會選擇這三個信號中的兩個，用來分析數(shù)據(jù)時去除黏連體，排除干擾，黏連的細(xì)胞通過檢測區(qū)域的時間更長，脈沖面積也更大。如圖2所示，使用FSC-A和FSC-H來去除黏連體，對角線位置上的是單細(xì)胞（2倍體和4倍體通過激光檢測口時，H和A是成正比增大的，兩者之間應(yīng)該是呈45度角分布；而粘連體通過時，H不變，A增大），紅色虛線框內(nèi)面積更大的是黏連體。若用FSC-A或者FSC-H與FSC-W組合來去除黏連體時，黏連體通過FSC-W較小的一群細(xì)胞來分析（圖3）。流式細(xì)胞儀采集或細(xì)胞分選單細(xì)胞數(shù)據(jù)時，黏連體不能用于分析或分選，因為他們無法確定每個熒光標(biāo)記的真實狀態(tài)。如果黏連體太多，除了對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，還會造成儀器管路的堵塞。在進(jìn)行細(xì)胞周期分析時，黏連體會默認(rèn)為分裂的細(xì)胞，若在分析時不去除，會導(dǎo)致G2M期細(xì)胞比例上升，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
圖2：FSC-A和FSC-H去除黏連體
除了FSC，其他每一個通道（熒光通道）都有這三個參數(shù)可以記錄。那么，在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時應(yīng)該選擇熒光通道的哪個參數(shù)呢？由于熒光信號的面積（A）是采用對熒光光通量進(jìn)行積分測量，通常反映的是細(xì)胞熒光的總和，熒光信號的高度（H）取決于每個細(xì)胞熒光的表達(dá)量，通常反映的是細(xì)胞單位面積上的熒光濃度，熒光信號的寬度（W）取決于細(xì)胞的大小，細(xì)胞越大，細(xì)胞通過激光檢測區(qū)域的時間越長，對應(yīng)的熒光信號寬度越大，由于熒光信號的寬度對熒光信號的結(jié)果不產(chǎn)生直接影響，因此一般在流式細(xì)胞儀上熒光信號默認(rèn)只收集了熒光信號的高度（H）和面積（A），通常熒光信號的面積（A）要比熒光信號的寬度（H）高一些(如圖4所示)。臨床和科研中使用A的時候比較多，特別在DNA多倍體測定時一定要使用A（這是因為熒光脈沖的面積比熒光脈沖的高度更能準(zhǔn)確反映 DNA 的含量，當(dāng)形狀差異較大，而 DNA 含量相等的兩個細(xì)胞，得到的熒光脈沖高度是不等的，而經(jīng)過對熒光信號積分后，所得到的信號值就相等），此外做熒光分辨率、熒光靈敏度等性能測試時也使用A。不過臨床應(yīng)用中的一些實驗也顯示，使用H時對于弱熒光細(xì)胞的辨識是有優(yōu)勢的，因此選用H也是可以的。通常情況下可以用其中的任何一個，根據(jù)實驗要求來作圖，儀器軟件就會根據(jù)設(shè)置顯示出最終的圖形了。但是要注意的是如果做雙色分析的A和H 的選擇要一致。
圖4PE熒光信號分別用H和A顯示
